CCK8检测试剂盒
SmartBuffers® Cell Counting Kit（CCK-8）
CCK-8 检测试剂盒
SmartBuffers®Cell Counting Kit（CCK-8）是一种基于 WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。
CCK-8 溶液可以直接加入到细胞样品中，不需要预配各种成分，酚红和血清对检测不会造成干扰。WST-8 在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物formazan。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。
WST-8 对细胞无明显毒性。加入 CCK-8 溶液显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，检测时间更加灵活，便于确定最佳测定时间。
本试剂盒尤其适用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等，可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。
产品特色：
Ø 比MTT，MTS或WST-1更敏感，数据可靠，重复性好
Ø 无需放射性同位素和有机溶剂，对细胞毒性低
Ø 即开即用，操作更简单，无需有机溶剂，省时省力
Ø 稳定性高，-20℃避光保存效期长达3年
Order Information订货信息：
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Art.No. 目录编码 |
Product Name 产品名称 |
Product Description 产品描述 |
Pack. 产品包装 |
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CCK-0005 |
CCK-8 检测试剂盒 |
500T |
5mL/管 |
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CCK-0050 |
CCK-8 检测试剂盒 |
5000T |
10*5mL/瓶 |
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CCK-1000 |
CCK-8 检测试剂盒 |
100,000T |
1L/瓶 |
存储条件：
-20°C干燥避光冻存，有效期长达三年。
2-8°C干燥避光保存，有效期至少一年。
反复冻融会导致背景增加，干扰您的检测。如果频繁使用，请将试剂盒存放在2-8°C。
操作步骤：
1. 制作标准曲线
a. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞；
b. 按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 5-7个细胞浓度梯度，每组 4-6 个复孔；
c. 接种后培养 2-4 小时使细胞贴壁，然后每 100 μL 培养基加 10 μL CCK-8试剂培养一定时间后测定 OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。使用此标准曲线的前提条件是试验条件完全一致。
2. 细胞活性检测
a. 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔) ，将培养板放在培养箱中预培养24 小时；
b. 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡) ；
c. 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时；
d. 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。
3. 细胞增殖-毒性检测
a. 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔) ，将培养板放在培养箱中预培养24 小时；
b. 向培养板加入不同浓度的待测药物；
c. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间；
d. 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡)；
e. 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时；
f. 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。
4. 计算公式
细胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%
抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%
As: 实验孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液) ；
Ac: 对照孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物) ；
Ab: 空白孔吸光度 (含培养基、CCK-8 溶液，不含细胞、药物) 。
注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK-8 之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次， 然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
注意事项及重要提醒：
1. CCK-8 的培养时间一般为 1-4 小时，但在培养 30 分钟左右即可取出肉眼观察显色程度，根据细胞种类而定，需要摸索条件，CCK-8 的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。
注意：白细胞可能需要培养较长时间。
2. 使用 96 孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于 96 孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的 PBS 、水或培养液；另一方面，可以把 96 孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。
3. 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂 (例如一些抗氧化剂) 会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。
4. 加入药物中如含有金属，对 CCK-8 显色有影响。终浓度为 1 mM 的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5% 、15% 、90% 的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是 10 mM 的话，将会 100% 抑制。
5. 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
6. 本产品可以检测E.coli ，但不能检测酵母细胞。向 100 μL E.coli 培养液 中加入 10 μL CCK-8 溶液，并培养 1-4 小时或过夜。
7. CCK-8 试剂对细胞的毒性非常低。它和活细胞内的脱氢酶持续反应使溶液颜色不断加深，OD 值不断增加 (注: 活细胞内的脱氢酶是持续产生的) 。
8. 要测定细胞的具体数量，建议同时做标准曲线。
9. 建议采用多通道移液器，以减小平行孔间的差异。
10. 以下方法可以终止 CCK-8 反应 (96 孔板) ：
(a). 在显色反应后，将培养板放置 4°C 冰箱内。(b). 每孔加 10 μL 0.1 M HCl 溶液。(c). 每孔加 10 μL 1% (w/v) 的 SDS (十二烷基硫酸钠) 溶液。
注意：反应停止后，应在 24 小时内测定。
11. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
12. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
常见问题解答 (FAQs)
1）Q：每个孔需要接种的细胞数量是多少？
A：对于贴壁细胞，每孔至少需要1000个细胞（100 μL培养基）。对于白细胞，由于灵敏度较低，每孔至少需要2500个细胞（100 μL培养基）。推荐的96孔板每孔最大细胞数为25000。如果使用24孔或6孔板进行该检测，请计算相应的每孔的细胞数，并调整CCK-8的体积，使其为每孔总液体体积的10%。
2）Q：CCK-8对细胞的毒性大小如何？
A：CCK-8的毒性非常低，在CCK-8测定完成后，相同的细胞可用于其他细胞增殖测定，例如结晶紫测定，中性红测定或DNA荧光测定。（除非细胞极为稀少，不推荐把CCK-8测定过的细胞用于其它实验。）
3）Q：怎么设置空白对照？
A：在不含有细胞的培养基中加入CCK-8，酶标仪检测450 nm的吸光度；若做药物刺激实验，可在不含细胞、含药物的培养基中加入CCK-8。酶标仪检测450 nm的吸光度作为空白对照。
4）Q：CCK-8能否用于细胞染色？
A：CCK-8不能用于细胞染色，CCK-8检测原理是高水溶性的四唑盐WST-8在电子耦合试剂存在下还原产生水溶性formazan形式的染料，WST-8及formazan是高度水溶性的，不会进入细胞内对细胞进行染色。
5）Q：没有450 nm的滤光片，能否使用其他滤光片？
A：如果您没有450 nm滤光片。您也可以使用吸光度在430 nm和490 nm之间的滤光片, 450 nm滤光片具有最佳灵敏度。
6）Q：哪些物质会干扰CCK-8的测定？
A：WST-8可能与还原剂反应生成WST-8 formazan，如果使用还原剂（例如一些抗氧化剂）会增加OD值；若存在氧化性物质则会抑制CCK-8测定反应，减小OD值；此外，培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
7）Q：在做药物刺激实验时，药物对测定是否有影响？
A：如果药物有还原性，则会与CCK-8发生反应，影响吸光度；药物中金属离子的存在可能会影响CCK-8的灵敏度。终浓度为1 mM 的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5% 、15% 、90%的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10 mM 的话，将会100%抑制。
8）Q：如果吸光度值太低，可以采取什么办法？
A：适当增加细胞数量或延长加入CCK-8溶液后的孵育时间。
9）Q：如果吸光度值太高，可以采取什么办法？
A：适当减少细胞数量（建议正式实验前优化细胞数量与荧光值之间的关系）或缩短加入CCK-8溶液后的孵育时间。
